C43（DE3） 電擊感受態細胞

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更新時間：2020-09-08

技術傳授:
凍存培養基
凍存細胞時必須使用推薦的凍存培養基。凍存培養基中應含有 DMSO 或者甘油等冷凍保護劑。還可使用專門配制的*凍存培養基。
1）細胞凍存培養基是一種用于哺乳動物細胞的即用型*凍存培養基，其所含胎牛血清和牛血清比例經過優化，可改善細胞活力以及解凍后的細胞復蘇效果。 
2）凍存培養基是一種化學成分確定的、無蛋白、無菌凍存培養基，含10% DMSO，適用于多種干細胞和原代細胞 (黑色素細胞除外) 的凍存。
培養細胞凍存方案
以下實驗方案介紹了培養細胞凍存的一般流程。詳細的實驗方案，必須參閱針對具體細胞的產品說明書。 
1.配制凍存培養基，于2°C至8°C下儲存，直至使用。請注意使用何種凍存培養基取決于所用細胞系。
2.凍存貼壁細胞時，利用傳代時所用方法輕柔地使細胞從組織培養容器上脫離下來。用該細胞所需*培養基重新懸浮細胞。
3.采用血球計數器、細胞計數儀按照臺盼藍拒染法或者使用 Countess®自動細胞計數儀測定總細胞數和活細胞百分比。根據所需活細胞密度，計算凍存培養基需要量。
4.以大約100-200×g的離心力將細胞懸液離心5至10分鐘。在無菌條件下小心倒掉上清液，不要攪動細胞沉淀。
注：離心速度和時間取決于細胞種類。
5.用預冷的凍存培養基重新懸浮細胞沉淀，將其調整至該細胞適合的活細胞密度。
6.將細胞懸液分裝到若干凍存管中。分裝時，應不時輕輕混合細胞，使其保持均勻的細胞懸液狀態。
7.產品僅用于科研使用可控制降溫速度的冷凍裝置冷凍細胞，使溫度每分鐘大約降低  1°C?；蛘?，將裝有細胞的凍存管放入凍存盒中，然后將凍存盒置于-80°C條件下過夜。 

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注意事項：
1. 感受態細胞應保存在 -70℃，不可多次凍融和放置時間過長，以避免降低感受態細胞的轉化效率。
2. 進行轉化操作時，應根據相應溫度及無菌條件的要求進行。
3. 產品僅用于科研為防止轉化實驗不成功，可以保留部分連接反應液，以重新轉化，將損失降到低。
實驗報告：
一、分離與培養：
1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，后將組織剪成1mm3左右大??；
2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養基終止消化后4℃放置；
3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復此步驟2-3次，直至組織*被消化；
4、用200目不銹鋼篩網過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養基混懸，接種于25cm2培養瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養箱中培養；
5、差速貼壁1h后，吸出培養基，按實驗需要接種于6孔板中繼續培養
二、免疫熒光鑒定：
1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；
2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；
3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；
4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗（Abbioscience公司），然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；
5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗37℃條件下放置1h；
6、用PBS沖洗3次，每次10min，后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。
操作方法（以下操作均按無菌條件的標準進行）
1 取感受態細胞置于冰浴中，如需分裝可將剛融化細胞懸液分裝到無菌預冷的離心管中，置于冰浴中。
●  一次轉化感受態細胞的建議用量為50-100 μl，可以根據實際情況分裝使用。應注意所用DNA 體積不要超過感受態細胞懸液體積的十分之一。
以下實驗以100 μl感受態細胞為例。
2 向感受態細胞懸液中加入目的DNA（100 μl 的感受態細胞能夠被1 ng 超螺旋質粒DNA 所飽和），輕輕旋轉離心管以混勻內容物，在冰浴中靜置30 分鐘。
3 將離心管置于42℃水浴中放置60-90 秒，然后快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻2-3 分鐘，該過程不要搖動離心管。
4 向每個離心管中加入900 μl 無菌的SOC 或LB 培養基（不含抗生素）， 混勻后置于37℃搖床振蕩培養1 小時（160-220 轉/分鐘），目的是使質粒上相關的抗性標記基因表達，使菌體復蘇。
5 將離心管內容物混勻，吸取100 μl 已轉化的感受態細胞加到含相應抗生素的SOB 或LB 固體瓊脂培養基上，用無菌的彎頭玻棒輕輕的將細胞均勻涂開。將平板置于室溫直至液體被吸收，倒置平板，37℃培養12-16 小時。
●  涂布用量可根據具體實驗來調整。如轉化的DNA 總量較多，可取更少量轉化產物涂布平板；反之，如轉化的DNA 總量較少，可取200-300 μl 轉化產物涂布平板。如果預計的克隆較少，可通過離心（4,000 rpm, 2分鐘）后吸除部分培養液，懸浮菌體后將其涂布于一個平板中。（涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的轉化菌落數過少可以將剩下的菌液再涂布新的培養板）
Porcine Interferon γ , IFN-γ Elisa KitTA-0910，他替瑞林Porcine/豬Elisa試劑盒規格：96T

Porcine telomerase, TE Elisa Kit促甲狀腺激素釋放激素，游離酸Porcine/豬Elisa試劑盒規格：48T

Porcine telomerase, TE Elisa Kit尿皮質激素Ⅲ，小鼠Porcine/豬Elisa試劑盒規格：96T

Porcine growth hormone releasing hormone, GHRH Elisa Kit纈絡肽（VQY），豬Porcine/豬Elisa試劑盒規格：48T

Porcine growth hormone releasing hormone, GHRH Elisa Kit血管活性腸肽Porcine/豬Elisa試劑盒規格：96T

Porcine Follicle-stimulating hormone, FSH Elisa KitZ-Ala-Ala-Leu-pNAPorcine/豬Elisa試劑盒規格：48T

Porcine Follicle-stimulating hormone, FSH Elisa Kit三亞甲基碳酸酯Porcine/豬Elisa試劑盒規格：96T

Porcine Carboxyterminal propeptide of type Ⅰ procollagen, PⅠCP Elisa Kit碳酸錳(>98%,BR)Porcine/豬Elisa試劑盒規格：48T

Porcine Carboxyterminal propeptide of type Ⅰ procollagen, PⅠCP Elisa Kit磷酸二氫錳(>98%,BR)Porcine/豬Elisa試劑盒規格：96T

Porcine Epithelial growth factor, EGF Elisa Kit松三糖單水；D-(+)-松三糖一水Porcine/豬Elisa試劑盒規格：48T

Porcine Epithelial growth factor, EGF Elisa Kit縮節胺(植物激素級)Porcine/豬Elisa試劑盒規格：96T

Porcine interleukin 8, IL-8 Elisa Kit偏磷酸(>38%(HPO3),BR)Porcine/豬Elisa試劑盒規格：48T

Porcine interleukin 8, IL-8 Elisa Kit肉桂酸甲酯(>98%,BR)Porcine/豬Elisa試劑盒規格：96T

Porcine Interleukin 6, IL-6 Elisa Kit二氫茉莉酮酸甲酯(植物激素級)Porcine/豬Elisa試劑盒規格：48T

Porcine Interleukin 6, IL-6 Elisa Kit吲哚-4-羧酸甲酯(>98%，BR)Porcine/豬Elisa試劑盒規格：96T

Porcine interleukin 4, IL-4 Elisa Kit次甲基綠(~65%,BS)Porcine/豬Elisa試劑盒規格：48T
C43(DE3) 電擊感受態細胞CBX1/HP1 β  異染色體同源蛋白1一抗    * 0.2ml Ammonium bromide

KMT3B/NSD1/ARA267  組蛋白基化KMT3B一抗（雄激素受體激活蛋白）    * 0.2ml Ammonium iodide

NFIC  核因子1C型一抗    * 0.2ml Ammonium iron(II) sulfate, hexahydrate

IKAROS  指蛋白IKAROS一抗    * 0.2ml Ammonium molybdate, tetrahydrate

Dbx2  大腦發育同源蛋白2一抗    * 0.2ml Ammonium phosphomolybdate , hydrate

HLX1  同源異型盒基因HLX1蛋白一抗    * 0.2ml Ammonium sodium phosphate

GTF2H1  通用轉錄因子2H肽1一抗    * 0.2ml Ammonium succinate

PHF8  組蛋白賴氨去基化酶PHF8一抗    * 0.2ml Ammonium thiosulfate