MSU440 感受態細胞

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更新時間：2020-09-08

技術傳授:
凍存培養基
凍存細胞時必須使用推薦的凍存培養基。凍存培養基中應含有 DMSO 或者甘油等冷凍保護劑。還可使用專門配制的*凍存培養基。
1）細胞凍存培養基是一種用于哺乳動物細胞的即用型*凍存培養基，其所含胎牛血清和牛血清比例經過優化，可改善細胞活力以及解凍后的細胞復蘇效果。 
2）凍存培養基是一種化學成分確定的、無蛋白、無菌凍存培養基，含10% DMSO，適用于多種干細胞和原代細胞 (黑色素細胞除外) 的凍存。
培養細胞凍存方案
以下實驗方案介紹了培養細胞凍存的一般流程。詳細的實驗方案，必須參閱針對具體細胞的產品說明書。 
1.配制凍存培養基，于2°C至8°C下儲存，直至使用。請注意使用何種凍存培養基取決于所用細胞系。
2.凍存貼壁細胞時，利用傳代時所用方法輕柔地使細胞從組織培養容器上脫離下來。用該細胞所需*培養基重新懸浮細胞。
3.采用血球計數器、細胞計數儀按照臺盼藍拒染法或者使用 Countess®自動細胞計數儀測定總細胞數和活細胞百分比。根據所需活細胞密度，計算凍存培養基需要量。
4.以大約100-200×g的離心力將細胞懸液離心5至10分鐘。在無菌條件下小心倒掉上清液，不要攪動細胞沉淀。
注：離心速度和時間取決于細胞種類。
5.用預冷的凍存培養基重新懸浮細胞沉淀，將其調整至該細胞適合的活細胞密度。
6.將細胞懸液分裝到若干凍存管中。分裝時，應不時輕輕混合細胞，使其保持均勻的細胞懸液狀態。
7.產品僅用于科研使用可控制降溫速度的冷凍裝置冷凍細胞，使溫度每分鐘大約降低  1°C?；蛘?，將裝有細胞的凍存管放入凍存盒中，然后將凍存盒置于-80°C條件下過夜。 

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注意事項：
1. 感受態細胞應保存在 -70℃，不可多次凍融和放置時間過長，以避免降低感受態細胞的轉化效率。
2. 進行轉化操作時，應根據相應溫度及無菌條件的要求進行。
3. 產品僅用于科研為防止轉化實驗不成功，可以保留部分連接反應液，以重新轉化，將損失降到低。
實驗報告：
一、分離與培養：
1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，后將組織剪成1mm3左右大??；
2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養基終止消化后4℃放置；
3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復此步驟2-3次，直至組織*被消化；
4、用200目不銹鋼篩網過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養基混懸，接種于25cm2培養瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養箱中培養；
5、差速貼壁1h后，吸出培養基，按實驗需要接種于6孔板中繼續培養
二、免疫熒光鑒定：
1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；
2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；
3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；
4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗（Abbioscience公司），然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；
5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗37℃條件下放置1h；
6、用PBS沖洗3次，每次10min，后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。
操作方法（以下操作均按無菌條件的標準進行）
1 取感受態細胞置于冰浴中，如需分裝可將剛融化細胞懸液分裝到無菌預冷的離心管中，置于冰浴中。
●  一次轉化感受態細胞的建議用量為50-100 μl，可以根據實際情況分裝使用。應注意所用DNA 體積不要超過感受態細胞懸液體積的十分之一。
以下實驗以100 μl感受態細胞為例。
2 向感受態細胞懸液中加入目的DNA（100 μl 的感受態細胞能夠被1 ng 超螺旋質粒DNA 所飽和），輕輕旋轉離心管以混勻內容物，在冰浴中靜置30 分鐘。
3 將離心管置于42℃水浴中放置60-90 秒，然后快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻2-3 分鐘，該過程不要搖動離心管。
4 向每個離心管中加入900 μl 無菌的SOC 或LB 培養基（不含抗生素）， 混勻后置于37℃搖床振蕩培養1 小時（160-220 轉/分鐘），目的是使質粒上相關的抗性標記基因表達，使菌體復蘇。
5 將離心管內容物混勻，吸取100 μl 已轉化的感受態細胞加到含相應抗生素的SOB 或LB 固體瓊脂培養基上，用無菌的彎頭玻棒輕輕的將細胞均勻涂開。將平板置于室溫直至液體被吸收，倒置平板，37℃培養12-16 小時。
●  涂布用量可根據具體實驗來調整。如轉化的DNA 總量較多，可取更少量轉化產物涂布平板；反之，如轉化的DNA 總量較少，可取200-300 μl 轉化產物涂布平板。如果預計的克隆較少，可通過離心（4,000 rpm, 2分鐘）后吸除部分培養液，懸浮菌體后將其涂布于一個平板中。（涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的轉化菌落數過少可以將剩下的菌液再涂布新的培養板）
血管緊張素Ⅳ檢測試劑盒  英文名稱:Taxinine B  純度：≥90%

血管緊張素Ⅴ檢測試劑盒  英文名稱:10-Deacetylbaccatin III  純度：≥98%

血管緊張素Ⅵ檢測試劑盒  英文名稱:Taxayunnansin A  純度：≥98%

血管緊張素Ⅶ檢測試劑盒  英文名稱:14β-Benzoyloxy-2-deacetylbaccatin VI  純度：≥98%

CXC趨化因子配體10檢測試劑盒  英文名稱:Baccatin III  純度：≥98%

乙醛氧化酶1檢測試劑盒  英文名稱:Sculponeatin O  純度：≥95%

可溶性B7同源體3檢測試劑盒  英文名稱:1-Hydroxybaccatin I  純度：≥96%

細胞色素P450c17檢測試劑盒  英文名稱:5,8,9,10,14-Pentaacetoxy-3-benzoyloxy-15-hydroxypepluane  純度：≥96%

P450膽固醇側鏈裂解酶檢測試劑盒  英文名稱:Sculponeatin K  純度：≥97%

多功能肽酶7檢測試劑盒  英文名稱:13-Hydroxy-8,11,13-podocarpatrien-18-oic acid  純度：≥97%

多功能肽酶2檢測試劑盒  英文名稱:Baccatin IV  純度：≥97%

糖皮質激素檢測試劑盒  英文名稱:12-Hydroxyabietic acid  純度：≥97%

磷酸化c-Jun氨基末端激酶檢測試劑盒  英文名稱:Methyl pseudolarate B  純度：≥98%

脆性X智力遲鈍蛋白1檢測試劑盒  英文名稱:Methyl pseudolarate A  純度：≥98%

信號素4D檢測試劑盒  英文名稱:Pseudolaric acid D  純度：≥98%

細胞角蛋白18檢測試劑盒  英文名稱:Rosenonolactone  純度：≥98%
MSU440 感受態細胞MtTF1  線粒體轉錄因子1一抗    * 0.2ml  Methyl cis13docosenoate

BarX1  BarX1蛋白一抗    * 0.2ml Nonadecanoic Acid

GOLPH2/GP73  高爾基體膜蛋白GP73一抗    * 0.2ml  Oleic acid

phosphoCstF64(Ser83)  化細胞分裂相關蛋白CSTF64一抗    * 0.1ml trans9Octadecenoic methyl ester

TET1/CXXC6  Teneleven轉運基因1蛋白一抗    * 0.2ml  Para Red

Calcium Sensing Receptor/CaSR  鈣敏感受體1一抗    * 0.2ml Petroselinic acid

DNA Polymerase beta  DNA聚合酶β一抗    * 0.2ml DPanthenol

STIM1  基質交感分子1一抗    * 0.2ml Saccharin sodium salt solution